ЛАВИБАКТ – биологический подход в борьбе с бактериозами

В течение последних десятилетий проблема бактериальных заболеваний растений в защищенном грунте стоит довольно остро. Активно изучаются сами фитопатогены, взаимодействие их с растением, пути проникновения в теплицу, а также предлагаются решения по предотвращению и борьбе с инфекцией. Сложность контроля данных заболеваний связана с высокой скоростью распространения, выработкой резистентности к антибиотическим химикатам, затрудненным контролем посевного материала или рассады и со способностью некоторых бактериальных культур образовывать биопленки на поверхности труб и капельных систем полива. Также значительную роль играет невозможность проведения культурооборота в некоторых теплицах. В результате инфекция может накапливаться от сезона к сезону.

Источники бактериальной инфекции

Один из источников поступления бактериальной инфекции в тепличное хозяйство – с семенами или рассадным материалом. Например, возбудитель заболевания бактериальный рак томата — Clavibacter michiganensis michiganensis, вызывающий сосудистые поражения у растений с последующим увяданием и гибелью, по данным исследователей накапливается, в том числе, и в семядолях семян. В данном случае поверхностная обработка посевного материала не приведет к желаемому результату. Остается только контроль семян с помощью анализа ПЦР или ИФА. Но для репрезентативности пробы для анализа необходимо по данным Европейской организации по защите растений (EPPO) отобрать минимум 10 000 шт. из одной партии, а это с учетом большого разнообразия гибридов томата в современных тепличных хозяйствах, становится практически невозможным, учитывая стоимость семян.

Еще один источник проникновения бактериальных возбудителей в теплицу – через поливные воды. Возбудитель заболевания «Бешенство корней» грамотрицательная бактерия Agrobacterium tumifacience, поражающая культуру томата и культуру огурца в защищенном грунте, в значительной степени переносится с водой и накапливается в субстрате. Фитопатогенные штаммы Агробактерии содержат в составе генома Ti/Ri- плазмиду, способную внедряться в ДНК растения и вызывать неконтролируемое разрастание корневой системы и образование галлов, что в свою очередь ведет к дисбалансу вегетативной и генеративной части, вызывает снижение урожайности, ослабление растения и, в некоторых случаях, гибель от сопутствующих заболеваний. Сложность борьбы с инфекцией заключается в способности фитопатогена образовывать биопленки на поверхностях поливных систем, накопителей итд (1). В этом случае только комплекс мер по очистке воды, качественной дезинфекции поливной системы в сочетании я агротехническими приемами и защитными обработками с использованием антибиотических препаратов поможет снизить интенсивность проявления болезни на культуре.

Популярная декоративная тепличная культура – роза, также серьезно страдает от возбудителя бактериального увядания Ralstonia solanacearum. Данный фитопатоген является карантинным объектом на территории РФ и рекомендуется к строгому контролю. Бактерия проникает в сосудистую систему вызывает повреждение проводящих флоэмных пучков с последующей дисфункцией центральных ксилемных. Растение проявляет симптомы увядания: засыхают листья, побеги, поврежденный куст отстает в росте и становится непродуктивным. Учитывая многолетнее выращивание данной культуры (6-10 лет на одном месте) применение любых химических фунгицидов и бактерицидов становятся неэффективным в долгосрочной перспективе. Пересадка пораженных участков также имеет низкую эффективность и опасность рецидива данного заболевания особенно возрастает при выращивании восприимчивых к данному заболеванию сортов.

Плюсы биометода в борьбе с бактериальными заболеваниями

Учитывая сложность и многогранность проблемы бактериальных заболеваний в защищенном грунте, биологический метод становится наиболее эффективным и приемлемым в условиях современных требований к качеству и безопасности производимой продукции. Многообразие благотворного эффекта на растение, которое привносит в экосистему положительный биоагент сложно в полной степени оценить простыми лабораторными и практическими экспериментами. Это не только физическое подавление роста возбудителя в пределах работы агента биологической защиты, но также и регулирование численности фитопатогена в течение определенного периода, фитостимулирование за счет выделения гормонов роста, ускорение восстановления растения после стрессовых воздействий. Также биологические агенты не вызывают развитие резистентности у целевого объекта и не теряют свою эффективность при применении в длительных оборотах.

Молочнокислые микроорганизмы

Молочнокислые организмы как биологические агенты для защиты растений активно исследуются в течение последних десяти лет (2). Польза применения данных микроорганизмов уже хорошо изучена и доказана в медицинской сфере, пищевом производстве, в сферах животноводства и птицеводства. Также отдельные группы молочнокислых бактерий используются для увеличения срока хранения и повышения безопасностиготовой продукции на полках магазинов и для обработки поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами. Например, исследование 2006 года показало, что колонии Lactobacillus rhamnosus, подавляют развитие болезнетворной для человека бактерии Listeria monocytogenes на поверхности яблок, не влияя при этом на качество и сохранность продукции. Кроме того, исследование 2013 года показало, что ряд пробиотиков из рода Lactobacillus sp. эффективно подавляют образование биопленок, образованных Salmonella enterica, с использованием механизмов вытеснения и замещения патогенного организма на пробиотический. Также исследования сообщают, что обработка стальных поверхностей культурой молочнокислых бактерий, уменьшает и контролирует дальнейшее образование биопленок Listeria monocytogenes, что в настоящее время широко используется в пищевом производстве (3).

Живые клетки молочнокислых бактерий, обладают целым рядом механизмов, которые участвуют в борьбе с бактериальными патогенами. Это и высокая скорость роста, обеспечивающая вытеснение целевого объекта и конкуренция за элементы питания. Но наибольший интерес вызывает способность данных микроорганизмов выделять ряд антибиотических компонентов напрямую подавляющих развитие потенциально патогенных микроорганизмов. Именно это свойство, как считают исследователи, играет главную роль в бактериальном антагонизме и установлении равновесия в ценозах. В случае молочнокислых бактерий это органические кислоты, в частности молочная кислота, перекись водорода, бактериоцины и биосурфактанты (биологические поверхностно-активные вещества). Бактериоцины - семейство секретируемых бактериями пептидов, обладающих антимикробной активностью и действующих против других штаммов того же или близкородственных видов. Лактобациллы могут секретировать целый ряд подобных пептидов, некоторые уже хорошо изучены и синтезируются в промышленном масштабе. Например, бактериоцины низин и педиоцин, синтезируемые Lactococcus lactis и Lactobacillus plantarum соответственно, одобрены для применения на пищевых производствах и используются в процессах безопасной консервации с разрешения управления по санитарному надзору и качеству пищевых продуктов и медикаментов (FDA). Также бактериоцины, синтезированные молочнокислыми организмами способны подавлять целевой патоген начиная с концентраций намного ниже, чем общепринятые антибиотики, синтезированные эукариотами (стрептомицетами, актиномицетами). Этот интересный и положительный факт ученые связывают с возможностью данных пептидов взаимодействовать со специфическими рецепторами целевых объектов (4).

Касательно краткой микробиологической характеристики молочнокислых бактерий это грамположительные неспорообразующие кислородотолерантные анаэробы, разнообразной формы от бацилл до кокков, которые устойчивы к кислой реакции среды. Температурный оптимум развития для мезофильных представителей лактобацилл в среднем от 25 до 300С. Сахара, в частности пентозы – ксилозу и рибозу – лактобациллы сбраживают по фосфокетолазному пути до молочной кислоты и ацетата, а гексозы (глюкоза, фруктоза и моноза) до лактата, этанола и CO2. В добавление к ферментам фотокеталазного пути в геноме молочнокислых бактерий есть гены кодирующие все ферменты гликолиза. Лактобациллы, особенно в этом отношении выделяется Lactobacillus plantarum, также имеют очень развитую и эффективную транспортную систему, которая позволяет поглощать нутриенты из окружающей среды. Это наряду с «неприхотливостью» к сбраживаемым сахарам, добавляет молочнокислым бактериями возможность эффективно занимать абсолютно разные ниши - от почв и поверхности растений, до кишечного тракта животных (4).

Лавибакт, Ж – биопрепарат на основе молочнокислых бактерий

Учитывая знания о природе, полезных свойствах, безопасности и необычайной адаптивности лактобацилл специалисты лаборатории ГК «БИОМ» создавали и изучали Лавибакт, Ж - биопрепарат для защиты растений, который в своем составе имеет живые молочнокислые бактерии с преобладанием Lactobacillus plantarum (109 КОЕ), как наиболее перспективного и подробно изученного пробиотика. При внесении препарата в капельный полив, микроорганизмы должны напрямую подавлять развитие бактериального фитопатогена за счет выделения в окружающую среду бактерицинов широкого спектра. Для обеспечения пролонгированного эффекта необходимо, чтобы биоагенты достаточно хорошо приживались в субстратах: почве, торфе, в кокосовых и минераловатных матах. При регулярном применении редуцировать образование пленок на поверхности поливных систем и регулировать численность поступления и распространение фитопатогенов с водой, оказывая, тем самым, благотворное влияние на всю экосистему теплицы.

Для доказательства антибактериальных свойств Лавибакта, Ж исследователи лаборатории ГК «БИОМ» использовали 5 фитопатогенных штаммов Clavibacter michiganensis michiganensis (В2221, В2222, В2223, В2224, В2225) - возбудителя бактериального рака томата и испытывали препарат в лабораторных условиях в сравнении с антибиотиками Бициллин (375 000 ЕД) и Стрептомицин (0, 25 г/л). В опыте Стрептомицин не показал антимикробной активности к грамположительному возбудителю бактериального рака томата. Бициллин показал средний результат с зоной задержки роста в среднем 2 мм. Лавибакт, Ж устойчиво сдерживал развитие фитопатогена, вызывая задержку роста в зоне действия препарата от 12 до 30 мм.

Также Лавибакт, Ж показал свою эффективность на бактериях рода Agrobacterium tumefaciens, выделенных из субстрата тепличного хозяйства с активными проявлениями симптомов болезни «Бешенство корней» (неконтролируемый рост корневой системы и образование галлов). На этот раз Стрептомицин (0, 25 г/л) в борьбе с грамотрицательным возбудителем показал средний результат с задержкой роста в 2 мм, Бициллин (375000 ЕД) не показал антимикробной активности, а Лавибакт, Ж вызвал задержку роста в зоне действия препарата в 12 мм.

Практический опыт применения Лавибакт, Ж

Эффективность молочнокислых бактерий против заболевания «Бешенство корней» также проверяли на практике в условиях тепличного хозяйства, выращивающего культуру огурца на светокультуре. В опыте при пересадке растений нижнюю сторону кубика с рассадой окунали в раствор препарата на основе молочнокислых бактерий перед установкой на постоянное место на мате в производственном отделении (барьерная обработка). Для приготовления рабочего раствора использовали поливную воду, температурой 20-230С, объемом 350-400 л и растворяли в ней 5 литров препарата. Данного кол-ва рабочего раствора хватает на обработку примерно 20 000 - 25 000 шт рассады огурца. Далее с периодичностью в 2 недели делали агрономическую оценку состояния растений и поверхности кубика, оценивая количество пораженных растений по сравнению с контрольной площадью. Подсчеты подтверждали с помощью микробиологических анализов и анализов ПЦР на наличие Ti/Ri плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Наблюдения в течение трехкратных измерений показало, снижение поражения в варианте с использованием препарата на основе молочнокислых организмов по сравнения с контролем на 20 %, кроме того, выраженность проявления заболевания была намного ниже в опыте с использованием лактобацилл для барьерной обработки.

Следующим этапом изучения свойств препарат Лавибакт, Ж были опыты, доказывающие присутствие молочнокислых бактерий при регулярных защитных обработках 1 раз в месяц через капельный полив в дозе 5 л на 1 га (5 л на 2000 - 4000 л поливного раствора) в минераловатном и торфяном субстрате. Для наблюдения за изменением биоценоза ежемесячно случайным образом отбирали минераловатный мат с растением, и изучали в разрезе в разных плоскостях. Микробиологический анализ показал, что в основном молочнокислые бактерии локализуются в нижней части мата, как наиболее анаэробной нише и элиминируются (уходят из субстрата) через 3-4 недели после применения. При изучении приживаемости лактобацилл в торфяных субстратах, микробиологические анализы субстрата показывали присутствие молочнокислых микроорганизмов в высоком титре до 30 суток после применения.

Практические рекомендации

Используя полученные данные, можно сформулировать ряд практических рекомендаций по использованию препарата Лавибакт, Ж в защищенном грунте:

1. При пересадке. Нижнюю поверхность кубика окунуть в раствор препарата и установить на постоянное место. Или обработать отверстия в напитанных матах в производственном отделении сразу перед установкой кубиков. Для приготовления рабочего раствора рекомендуется использовать 5 л препарата на 20-25 тыс. растений, растворенного в 300-400 л поливной воды комнатной температуры.
2. Ежемесячно в капельный полив при заболеваниях бактериальный рак томата (возбудитель Clavibacter m.m.) и «бешенство корней» (возбудитель A. tumefaciens) в схеме биологической и интегрированной защиты растений. Для обработки рекомендуется использовать 5 л препарата растворенного в 2-4 тыс. литрах питательного раствора на любом этапе приготовления.
3. Для барьерной обработки и ежемесячных поливов культуры розы в защищенном грунте, проявляющей симптомы бактериального увядания (возбудитель Ralstonia solanacearum). Из-за карантинного статуса данного фитопатогена, изучение его как в лабораторных условиях, так и в условиях открытого грунта остается весьма затруднительным. Но учитывая широкий спектр действия бактерицинов, синтезируемых лактобациллами, Лавибакт, Ж очень перспективен в борьбе сданным фитопатогеном.

Список используемой литературы:

1. Bosmans, L., Van Calenberge, B., Paeleman, A., Moerkens, R., Wittemans, L., Van Kerckhove, S., De Mot, R., Lievens, B., and Rediers, H. (2016b). Efficacy of hydrogen peroxide treatment for control of hairy root disease caused by rhizogenic agrobacteria. J. Appl. Microbiol. 121 (2), 519–527.
2. John R. Lamont, Olivia Wilkins, Margaret Bywater-Ekeg€ard , Donald L. Smith (2017). From yogurt to yield: Potential applications of lactic acid bacteria in plant production. Soil Biology & Biochemistry 111, 1-9.
3. Md. Iqbal Hossain, Mohammad Sadekuzzaman, Sang-Do Ha, (2017). Probiotics as potential alternative biocontrol agents in the agriculture and food industries. Food Research International 100 (2017) 63–73.
4. Sabrina da Silva Sabo, Michele Vitolo, José Manuel Domínguez González, Ricardo Pinheiro de Souza Oliveira, (2014). Overview of Lactobacillus plantarum as a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria. Food Research International 64 (2014) 527–536.